股票代码：838645
400-0438-177
非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒说明书
【兽药名称】
通用名：非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒
商品名: 无
英文名：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Fluorescence Fast Detection Kit
【用途】
本试剂盒适用于检测病料核酸中的非洲猪瘟病毒（ASFV）DNA，检测结果可用于非洲猪瘟病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】
本试剂盒利用针对非洲猪瘟病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，配以PCR反应液等组分，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现非洲猪瘟病毒 DNA的快速检测。
PCR检测体系含有阳性内对照（内标），通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。
【主要组成成份】
|
序号 |
试剂名称 |
规格与装量 |
主要成分 |
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1 |
ASFV-酶混合液 |
100μl/管×1管 |
DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶 |
|
2 |
ASFV-内标 |
50μl/管×1管 |
含内标基因片段的克隆质粒 |
|
3 |
ASFV-核酸释放剂 |
250μl/管×1管 |
SDS、TE等 |
|
4 |
ASFV-PCR反应液 |
950μl/管×2管 |
引物、探针、dNTPs、镁离子、PCR缓冲液 |
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5 |
ASFV-阴性对照 |
50μl/管×1管 |
灭菌生理盐水 |
|
6 |
ASFV-阳性对照 |
50μl/管×1管 |
含目标序列的克隆质粒 |
备注：1）不同批号产品的成分之间不可以混用或互换。
【适用仪器】
适用于ABI7500荧光PCR仪、SLAN-96P、SLAN-24P荧光PCR仪等。
【样本要求】
1.适用样本类型：血清、血浆、组织匀浆液上清等。
2.样本保存和运送：长期保存请置于-20℃以下。标本运送采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
【检验方法】
1 试剂准备（在试剂准备区进行）
1.1 取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用；
1.2 根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例（反应液38μl/人份+酶混合液 2.0μl/人份+内标1.0μl/人份）取相应量的反应液、酶混合液及内标，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。
2 样本处理与加样（在样本处理区进行）
2.1 加样
2.1.1每个PCR反应管中加入核酸释放剂5μl（建议深吸浅打，避免出现气泡），然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各5μl，吸打3-5次混匀（轻轻吸打，避免出现气泡）；室温静置10分钟以上。
2.1.2每管加入PCR-mix 40μl，吸打混匀2-3次，盖上管盖（去除气泡后），2000rpm离心30 秒。
3 PCR 扩增（请参照各仪器使用说明书进行设置）
3.1 将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及未知样本，并设置样本名称。
3.2 荧光检测通道选择：
3.2.1 SLAN 、ABI、Stratagene系列仪器：
选择FAM通道（Reporter:FAM, Quencher:none）检测ASFV-DNA；2）选择HEX 或VIC通道（Reporter:HEX/VIC, Quencher:none）检测内标；3）参比荧光（Passive Reference）设置为none。设置Sample Volume为50。
3.3 循环参数设定(SLAN 24等具备12℃升降温的仪器可执行FAST程序)：
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步骤 |
常规程序 |
FAST程序* |
|||||
|
温度 |
时间 |
循环数 |
温度 |
时间 |
循环数 |
||
|
1 |
UNG 酶反应 |
50℃ |
2 分钟 |
1 |
|
|
|
|
2 |
Taq 酶活化 |
95℃ |
2 分钟 |
1 |
95℃ |
2 分钟 |
1 |
|
3 |
变性 |
95℃ |
15 秒 |
40 |
95℃ |
3 秒 |
40 |
|
退火，延伸，荧光采集 |
60℃ |
30 秒 |
60℃ |
20 秒 |
|||
|
4 |
仪器冷却 |
25℃ |
10 秒 |
1 |
|
|
|
3.3.1 ABI、Stratagene仪器参数设置（*注：由于ABI7500仪器原因，不能设置为30秒，可以设置为31秒或32秒）
4. 结果分析（请参照各仪器使用说明书进行设置，以下分析以ABI系列仪器为例）反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analyze进行分析，使各项参数符合下述“5. 质量控制”中的要求，然后到Plate窗口下记录Ct值。
5. 质量控制
5.1 ASFV-阴性对照：Ct值无显示；但内标检测为阳性，且Ct值≤40。
5.2 ASFV-阳性对照：Ct值≤35。
5.3 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
【参考值（参考范围）】
通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为39，检测内标的Ct参考值为40。
【检验结果的解释】
1 阴阳性判断：
1.1 对于测定Ct值≤35的样本，报告为ASFV- DNA阳性；
1.2 对于测定35≤Ct值<40的样本，报告为ASFV- DNA可疑，需对该样本复测，若Ct值≤40，报告为ASFV- DNA阳性，若Ct值>40，报告为ASFV- DNA低于试剂盒检测下限。
1.3 对于测定Ct值>40 的样本，同时，内标检测为阳性（Ct值≤40），报告注明ASFV- DNA低于试剂盒检测下限；若内标Ct值> 40或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验（若重复试验的检测结果仍无效，请与本公司联系）。
【检测方法的局限性】
样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关，其中任何失误都将会导致结果不准确。如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。
【产品性能指标】
本试剂盒检测企业工作参考品，阴、阳性符合率均为100%；精密度试验表明批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数均<10%，浓度值变异系数均<50%；本试剂盒最低检出量为4.00E+02 copies/mL；
【注意事项】
1. 本品仅用于兽医诊断使用，使用前请仔细阅读本说明书。
2. 试验前请熟悉和掌握需使用的各种仪器的操作方法和注意事项，对每次实验进行质量控制。
3. 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行，所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用。
4. 所有检测样品应视为具有传染性物质，实验过程中穿工作服，戴一次性手套并经常替换手套以避免样品间的交叉污染；样本操作、废弃物处理均需符合相关法规要求：《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
5. 所有的试剂在使用前，均需在室温下充分融化、混匀后使用。
【规格】50反应/盒
【储存条件及有效期】试剂应避光密闭储存于-20±5℃；试剂盒有效期为12个月，避免反复冻融。
【生产企业】吉林和元生物工程股份有限公司
